通过聚集诱导发光活性的多孔有机笼增强生物成像

多孔有机笼（POCs）具有优越的微环境、良好的分散性和形状均一性、优异的分子溶解性、高化学稳定性和有趣的主客体化学等优点。这些特性使POCs能够克服扩展多孔网络的局限性。但由于其刚性和疏水结构，POCs在生物成像中的应用仍然受到限制，从而容易导致在水性生物介质中发生强聚集引起的荧光猝灭（ACQ）。动态亚胺键（C=N）是POCs中最常见的构筑单元，对具有不同连接几何形状的单体对POCs的空腔大小和形状进行精确微调，对于多孔性和主-客封装至关重要。而且POCs很容易后修饰以调节化学微环境（如：功能基团和亲水性特性），这为其后续应用奠定基础。

POCs虽可有效地避免小分子在水溶液中的聚集荧光猝灭（ACQ），但其在生物成像应用方面仍有挑战：（I）POCs的相对疏水表面导致水环境中笼子聚集过大而无法穿透细胞；（II）由于ACQ效应导致荧光减弱，这限制其生物应用，如生物成像和药物输送；（III）结构刚性会限制POCs对环境变化缺乏响应。因此，合成具有亲水表面、高荧光发射和敏感刺激响应特征的POCs，可扩大其在生物方面的应用。

本文中，作者制备了具有AIE活性的POCs，该POCs能够刺激响应以增强生物成像（图1）。POCs在水溶液中具有动态和亲水性。此外，POCs的柔性构象导致了TPE基苯环的动态变化，其对温度和粘度等环境变化具有荧光响应。同时还实现了高效的活细胞成像，为开发AIE活性超分子POCs为未来的生物应用提供了一种可行的方法。

图1. 具有亲水性和刺激响应特性的AIE活性POCs用于增强生物成像。

如图2所示，以ETTBA为构建块，三(2-氨基乙基）胺为顶点合成[6+8]型亚胺笼。TPE-cage空腔约1.2 nm，其刚性亚胺键严重限制TPE苯环的旋转。但将笼中的刚性亚胺键还原为相对灵活的胺键（C−N），TPE的苯环可以表现出AIE特征。因此作者将TPE-cage还原为R-TPE-cage（图2b）。此外，R-TPE-cage可以进一步酸化，生成具有极强亲水性的带正电荷的R(+)-TPE-cage（图2c）。

图2. (a) TPE-cage；(b) R-TPE-cage和R(+)-TPE-cage的合成路线；(d-i) POCs的HOMO−LUMO。

图3a的N^1s的高分辨XPS显示R(+)-TPE-cage比TPE-cage的结合能更高，从而证实了亚胺键的转化。通过Zeta电位测量明确显示了R(+)-TPE-cage的形成。如图3b所示，TPE-cage，R-TPE-cage，R(+)-TPE-cage的电位分别为-17.5 mV，24.6 mV和33.5 mV。此外，作者还测量了POCs的接触角表明疏水-亲水性质的变化，三者的接触角分别为108.4°，95.2°和79.6°。作者进一步研究了POCs的光物理性质。与TPE-cage相比，R-TPE-cage和R(+)-TPE-cage的紫外光谱和荧光光谱均发生蓝移（图3c和4a-c）。

图3. POCs的(a) 高分辨率N^1s XPS光谱；(b) Zeta电位值；(c) 298 K固态荧光发射光谱；(d) 在水溶液中的DLS；(e) 水溶液中的荧光照片；(f) 水溶液中的光学照片（丁达尔效应）。

生物应用的一个先决条件是材料在水溶液中具有适当的粒度。作者通过TEM和SEM对POCs进行了形态表征。如图4d所示，FE-SEM图像显示TPE-cage由于其疏水性和刚性苯环聚集成10 μm的颗粒。而R-TPE-cage由于其结构灵活性降低了分子堆积，显示出更小的尺寸和更少的分子聚集（图4e）。R(+)-TPE-cage的粒径在100-200 nm之间（图4f），这表明柔性笼结构内的正电荷增强了亲水性并防止水溶液中的超分子聚集。图4g-i的HR-TEM也与SEM图结果一致。从结构角度来看，R(+)-TPE-cage由于其正电荷和柔性结构破坏了分子间的堆积，而相对刚性的TPE-cage可以通过超分子相互作用容易聚集。DLS研究表明，POCs在水中的平均粒径分别为21.6 μm，1.1 μm，36 nm（图3d）。此外，TPE-cage和R-TPE-cage的水悬浮液表现出Tyndall效应，而R(+)-TPE-cage不存在这种效应（图3e，f）。因此，R(+)-TPE-cage几乎是水溶性的，突出了柔性结构和亲水性对有机笼的物理性质的重要性。

图4. (a-c) POCs的光学照片；POCs在水中分散后的(d-f) FE-SEM图像；(g-i) HR-TEM图像；(j-l) AFM图像。

作者对R(+)-TPE-cage进行了温度和粘度的荧光响应测量。如图5a所示，从0℃到80℃，其荧光强度下降了80.2%。这是由于苯环转子在温度升高时动力增强，从而通过非辐射途径耗散能量降低了荧光发射。其温度依赖性接近线性（R² = 0.9792，图5c），R-TPE-cage也观察到类似的趋势。此外，温度循环实验表明，R-TPE-cage和R(+)-TPE-cage可实现高度可逆旋转（图5b）。如图5d所示，POCs的寿命值与温度呈线性关系（图5d）。此外，R(+)-TPE-cage的寿命增加程度最高。这一结果表明R(+)-TPE-cage具有更多的动力学特征，与变温荧光实验结果一致。

此外，作者还测量了R(+)-TPE-cage对粘度的荧光响应。荧光强度随着粘度的增加而增强（图5e，f）。这表明R(+)-TPE-cage对环境粘度高度敏感，因为TPE基苯环的分子旋转受到高粘度的阻碍。同时也证实了R(+)-TPE-cage将亚胺键还原为柔性胺键后，笼具有更大的结构动力学和灵活性。

图5. (a) R(+)-TPE-cage随温度的荧光变化；(b)R(+)-TPE-cage加热和冷却后荧光强度变化；(c) POCs在不同温度下的相对荧光强度（I/I_0°C）；(d)R(+)-TPE-cage在不同温度下的寿命值变化；(e)R(+)-TPE-cage在不同粘度溶液中的荧光变化；(f)R(+)-TPE-cage在一定粘度范围内的相对荧光强度（I/I1_cP）。

纳米R(+)-TPE-cage的AIE效应和亲水性促使作者评估其在活细胞成像中适用性（图6）。首先作者测定了POCs细胞毒性。与HeLa细胞和NIH-3T3细胞孵育24小时后，与对照组相比，POCs没有降低细胞活力（图7a，b），表明它们在体外应用方面具有良好的生物相容性。为了确定POCs对细胞摄取效率的影响，作者使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）在相同的采集设置下通过延时成像捕获了内化过程。如图6a-c所示，根据染色后0.5-3小时的图像，荧光强度逐渐增加。TPE-cage的细胞摄取效率较差，R-TPE-cage的细胞摄取能力较强，在细胞质区域有荧光。而正电荷可以促进细胞摄取。因此由于具有亲水性和柔韧性，R(+)-TPE-cage具有这三个结构中最高的细胞摄取率（图6c）。上述结果表明，具有柔性结构和带电表面的POCs具有更高的细胞摄取效率。流式细胞术分析也证实上述结果（图7c-e）。在相同条件下用三个笼子孵育HeLa细胞。即使在3小时后，仅有7.67%的TPE-cage细胞信号超过对照阈值。而在R-TPE-cage和R(+)-TPE-cage孵育下有89.48%和93.15%的细胞超过了阈值。此外，R-TPE-cage和R(+)-TPE-cage可有效应用于不同的细胞系的分子成像（图6d）。

图6. (a-c) 在培养0.5、1、2和3小时后，使用POCs对HeLa细胞共聚焦显微镜成像；在相同条件下，使用(d) R-TPE-cage和(e) R(+)-TPE-cage对HeLa、MCF-7、MDA-MB-MB-231和NIH-3T3细胞进行共聚焦显微镜成像。

图7. 三种笼对(a) HeLa细胞；(b) NIH-3T3细胞的细胞毒性实验结果；(c) TPE-cage(d) R-TPE-cage和(e) R(+)-TPE-cage的流式细胞术检测分析。

纳米POCs是一种多功能容器，能够识别和封装小分子或稳定超小金属纳米颗粒。因此作者探索了文中报道的POCs作为体外给药系统的可能性。由于顶点内有丰富的氮原子和高度芳香的壁。作者通过主客化学制备了Ag-NPS@R-TPE-cage和AgNPs@R(+)-TPE-cage（图8a）。随后，两种材料与HeLa细胞孵育，在细胞质区域观察到强信号（图8b，c）。这项初步研究进一步表明，这些具有AIE活性的POCs是体外给药系统的潜在候选者。

图8. (a) 制备Ag-NPS@R-TPE-cage和AgNPs@R(+)-TPE-cage的示意图；(b) Ag-NPS@R-TPE-cage；(c)AgNPs@R(+)-TPE-cage对HeLa细胞共聚焦显微镜成像。

本文中，作者开发出一种具有AIE活性的POCs。POCs的后修饰释放了基于TPE的苯环的动力学性能，形成具有高度AIE活性的R-TPE-cage和R(+)-TPE-cage。这些AIE特征在笼子对外界刺激（包括温度和粘度）的反应中具有明显的荧光变化。R(+)-TPE-cage已被证明对活细胞成像具有高效率和普遍性，以及可以作为体外递送的潜在候选者。本文证明了通过结构后修饰超分子POCs的策略为开发具有各种潜在生物应用的分子笼材料提供了识别癌细胞、药物输送、跨膜转运和光动力治疗的能力。

文献详情

Title: Enhanced Biological Imaging via AggregationInduced Emission Active Porous Organic Cages

Authors: Jinqiao Dong,* Yutong Pan, Kuiwei Yang, Yi Di Yuan, Vanessa Wee, Shidang Xu, Yuxiang Wang, Jianwen Jiang,* Bin Liu,* and Dan Zhao*.

Cite: ACS Nano.,2022, 16, 2355−2368.

DOI: 10.1021/acsnano.1c08605.

湖南大学何清课题组

研究方向｜超分子化学

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